南京肽业YM说多肽|糖肽合成专题——复杂糖基化氨基酸的保护、偶联与立体化学博弈

南京肽业YM说多肽 

糖肽合成专题

复杂糖基化氨基酸的保护、偶联与立体化学博弈

核心要义： 糖肽合成是多肽化学中复杂度最高的前沿领域之一，它要求在精确控制多肽序列的同时，将结构复杂、高度功能化的糖链以特定糖苷键（α/β构型）连接到特定氨基酸侧链（通常是Ser/Thr/Asn）。这不仅是对保护基正交性艺术的极致考验，更是对糖化学与肽化学融合的挑战。

一、 糖肽的生物学意义与合成挑战

1. 为何重要？ 蛋白质糖基化是最重要、最复杂的翻译后修饰之一，深刻影响蛋白质的折叠、稳定性、免疫原性、细胞识别与信号转导。合成结构均一的糖肽是研究这些功能的基础工具，也是开发糖蛋白药物和疫苗的关键。

2. 核心合成挑战：

   • 糖基的敏感性： 糖环上的众多羟基和糖苷键对强酸、强碱、某些金属离子和还原剂敏感，这与多肽合成所需的剧烈条件（如TFA切割、哌啶脱Fmoc）存在根本冲突。

   • 正交性要求的极端化： 需要设计能在多肽合成全过程中稳定存在，最后又能被选择性、温和脱除的糖基保护基。

   • 糖苷键构建的立体选择性： 无论是N-连接（Asn）还是O-连接（Ser/Thr），形成糖苷键时都必须严格控制其立体构型（α或β），这需要精妙的糖基供体设计和活化策略。

   • 溶解性问题： 高度糖基化的肽段亲水性极强，在固相合成常用的有机溶剂（如DMF， DCM）中溶解性和树脂溶胀性差，导致偶联效率低下。

二、 糖基化氨基酸构建单元：设计与合成

这是糖肽合成的基石。策略主要分为“预组装糖氨基酸”和“后糖基化”两条路径。

1. 预组装糖氨基酸策略

• 概念： 在溶液相中，预先将带有全保护糖基的糖链连接到适当保护的氨基酸侧链上，形成一个结构明确的“糖基化-氨基酸”单体（如Fmoc-Ser[Ac₄-β-D-GlcNAc]-OH）。

• 优势：

  • 结构明确： 糖苷键的构型在单体阶段就已通过经典的糖化学方法精确控制并得到表征。

  • 固相合成简便： 该单体可像普通保护氨基酸一样直接用于Fmoc-SPPS，简化了在树脂上进行复杂糖化学的操作。

• 挑战：

  • 单体合成极具挑战： 需要多步有机合成，涉及复杂的糖基保护/去保护，总产率低，是主要瓶颈。

  • 灵活性差： 一旦单体合成，糖链结构即固定，难以在肽链上对糖链进行后续修饰或延伸。

2. 糖基化氨基酸单体的保护基设计
糖环上的羟基通常采用两类保护基，其选择取决于多肽合成策略：

• 酯类保护基（如乙酰基 Ac， 氯乙酰基 ClAc）：

  • 稳定性： 对碱不稳定，但对酸稳定。

  • 应用场景： 主要用于 Boc-SPPS策略。因为Boc策略的最终脱保护是强酸（HF或TFMSA），酯基在此条件下稳定，可在最后一步与侧链保护基一同脱除。但与Fmoc-SPPS不兼容，因为Fmoc脱保护所用的哌啶碱会脱除酯基。

• 醚类保护基（如苄基 Bn， 对甲氧基苄基 PMB）：

  • 稳定性： 对碱稳定，但对酸不稳定（或可通过氢化脱除）。

  • 应用场景： 主要用于 Fmoc-SPPS策略。在哌啶脱Fmoc时稳定，最终用TFA切割时，可与肽链的tBu等侧链保护基一同脱除。部分苄基可能需要额外使用氢化或路易斯酸条件脱除。

三、 固相糖肽合成核心策略

策略A：线性Fmoc-SPPS使用预组装单体
这是目前最主流、最可靠的方法。

1. 流程： 直接使用Fmoc保护的、糖基为苄醚类保护（如Bn）的糖氨基酸单体进行标准偶联。

2. 关键： 确保单体在偶联和多次哌啶处理下稳定。脱保护后，最终用强酸TFA切割，一步脱除所有侧链保护基和糖基的苄醚保护。若糖基上有对酸敏感的特殊保护基（如乙酰基），则需在切割后进行额外的温和碱处理（如氨甲醇）。

3. 优点： 操作标准化，易于自动化，适用于合成O-连接糖肽和含有核心五糖（如Man₃GlcNAc₂）的N-连接糖肽。

策略B：固相上的糖链延伸
对于更复杂的分支寡糖链，常采用汇聚与线性结合的策略。

1. 在树脂上引入糖基化“起点”： 先通过预组装单体引入第一个糖（如与Ser/Thr相连的GalNAc，或与Asn相连的GlcNAc）。

2. 选择性脱除糖基上的临时保护基： 在树脂上，选择性地脱去糖基特定位置（如C-3， C-6）的临时保护基（如乙酰基、氯乙酰基），暴露出游离羟基。

3. 糖基化反应： 使用活化好的糖基供体（如糖基三氯乙酰亚胺酯，即“施密特糖苷化试剂”）在树脂上与暴露的羟基反应，延伸糖链。此步骤对立体选择性控制要求极高。

4. 迭代： 重复“选择性去保护-糖基化”循环，逐步构建复杂寡糖。这要求每一步的化学反应都与固相载体兼容，且产率足够高。

四、 正交保护与“正交去保护糖基化”

这是合成多位点、异质糖基化糖肽的尖端技术。

• 概念： 在同一个糖肽的不同位点引入带有不同保护基的相同糖基（例如，一个位点用对光不稳定的保护基，另一位点用对氟离子不稳定的保护基）。在合成完成后，通过不同刺激（光、氟离子）选择性地移除特定糖基上的保护，从而允许对该位点的糖链进行差异化后修饰。

• 示例： 一个糖肽的两个苏氨酸上各连接了一个全保护的半乳糖。其中一个半乳糖的C-6羟基被光不稳定的硝基苄基保护，另一个则被叔丁基二苯基硅基保护。合成后，先用光照脱除硝基苄基，暴露出一个C-6羟基，可将其磺酸化；随后用氟化物脱除TBDPS，暴露出另一个C-6羟基，可将其连接另一个糖。这就实现了对同一糖肽上不同位点糖链的精准编辑。

五、 合成后折叠与功能

化学合成的糖肽是线性或部分折叠的，其生物学功能依赖于正确的三维结构。

1. 糖基化引导折叠： 糖链的巨大亲水性和空间位阻能强烈影响多肽的局部构象和整体折叠路径。例如，特定的N-连接糖链可作为“内部分子伴侣”，辅助蛋白质的正确折叠。

2. 折叠验证： 需要通过圆二色谱、核磁共振等技术验证合成糖肽的二级和三级结构是否与天然糖蛋白结构域一致。

六、 应用与前沿

1. 糖疫苗开发： 合成肿瘤相关糖抗原与载体蛋白的多肽表位连接物，用于激发特异性免疫反应。

2. 糖蛋白相互作用研究： 合成结构精确的糖肽，用于筛选与凝集素、抗体或病毒刺突蛋白（如SARS-CoV-2的S蛋白）的结合，阐明糖链在识别中的精确作用。

3. 酶底物与抑制剂： 合成糖基转移酶或糖苷酶的底物/抑制剂，研究其机制或用于药物开发。

4. 均相糖蛋白药物的化学合成： 通过天然化学连接等技术，将合成的糖肽片段与大的蛋白片段连接，获得结构完全均一的全合成糖蛋白（如合成促红细胞生成素EPO的活性结构域）。

总结：
糖肽合成是站在多肽化学和糖化学两个巨人肩膀上的学科。它迫使化学家发展出最精巧的保护基策略，以调和两个领域对反应条件的苛刻且矛盾的要求。无论是采用预组装的“聪明单体”，还是勇于在固相上进行糖链延伸的“化学雕塑”，其目标都是获得那把结构精准的“钥匙”——用于解锁糖基化在生命科学中深藏的奥秘。随着化学酶法合成、自动化平台和人工智能辅助设计的发展，这一领域正从一门艺术逐渐走向可预测和规模化，为糖科学和糖药物时代奠定坚实的物质基础。