南京肽业YM说多肽|磷酸化多肽合成——磷酸基团的保护与去保护，以及对酸、碱的特殊敏感性处理

南京肽业YM说多肽

磷酸化多肽合成

磷酸基团的保护与去保护，以及对酸、碱的特殊敏感性处理

核心要义

磷酸化多肽的合成是多肽化学中对条件控制要求最严苛的领域之一。磷酸基团（尤其是Ser/Thr的磷酸酯）同时面临酸催化水解和碱催化β-消除的双重威胁。成功的合成需要精心设计保护基策略，在合成过程中维持磷酸基团的完整，并在最终实现其选择性脱保护。

一、 磷酸化氨基酸的化学脆弱性与副反应机制

1. 双重不稳定性

   • 酸敏感性：磷酸酯键在强酸（如TFA、HF）中可发生水解，回归游离磷酸。

   • 碱敏感性：在碱性条件下（如哌啶、DBU），磷酸化的Ser/Thr经历E2消除反应，磷酸基作为离去基团，导致Cβ-H消除，生成脱氢氨基酸衍生物（如脱氢丙氨酸）并释放磷酸二价阴离子。此反应迅速且不可逆。

2. 空间与电子效应

   • 磷酸基团的体积和强负电性可能干扰肽链折叠，降低树脂溶胀和偶联效率。

   • 磷酸化氨基酸的α-氢酸性增强，在活化与偶联时消旋风险增加。

二、 磷酸基保护基的进化与选择逻辑

保护策略的核心是：引入合适的保护基，屏蔽磷酸的酸/碱敏感性，使其在合成中惰性，最后在特定条件下温和脱除。

1. 苄基保护体系

• 代表单体：Fmoc-Ser/Thr/Tyr(PO(OBzl)₂)-OH

• 稳定性：

  • 耐碱：二苄基保护显著降低磷酸酯的离去能力，在哌啶脱Fmoc时能有效抑制β-消除。

  • 酸不稳定：可用强酸（TFA、HBr/AcOH）或氢解脱除。

• 应用：Fmoc-SPPS的主流选择。需在最终切割中使用强化TFA配方，并添加大量清除剂（如TES、H₂O）捕获苄基正离子，防止烷基化副反应。

• 变体：Fmoc-Tyr(PO(OBzl)₂)-OH更稳定，但苄基脱除需要更强条件（如延长切割时间或加入巯基清除剂）。

2. 叔丁基保护体系

• 代表单体：Boc-Ser/Thr/Tyr(PO(OtBu)₂)-OH

• 稳定性：

  • 碱不稳定：tBu酯在碱性条件下易消除，与Fmoc-SPPS不兼容。

  • 酸敏感：在TFA中可顺利脱除。

• 应用：主要用于Boc-SPPS，其α-氨基的TFA脱保护对磷酸二叔丁酯影响小，最终用HF或TFMSA实现全局脱保护。

3. 烯丙基保护体系

• 代表单体：Fmoc-Ser/Thr/Tyr(PO(OAllyl)₂)-OH

• 稳定性：

  • 耐碱、耐弱酸：可耐受哌啶和标准TFA切割条件。

  • 正交脱除：在Pd(0)催化下（如Pd(PPh₃)₄），经亲核试剂（如吗啉、N-甲基哌啶）进攻，实现温和、选择性脱保护。

• 应用：用于复杂正交策略。可在TFA切割前或后，用Pd(0)脱除磷酸保护，避免强酸对磷酸酯的可能损伤。

4. 环状保护策略

• 设计原理：将磷酸基与氨基酸侧链羟基形成稳定的环状衍生物（如2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷），彻底消除β-消除风险。

• 脱保护：合成后，在特定条件（如氧化/水解）下开环，再生磷酸酯。

• 优点：合成过程中绝对稳定。

• 缺点：单体合成复杂，开环条件可能苛刻。

三、 固相合成中的实战优化

策略：采用Fmoc-SPPS与二苄基保护磷酸化氨基酸

1. 单体预处理

   • 磷酸化氨基酸吸湿性强，使用前需充分干燥（P₂O₅真空干燥）。

   • 用无水DMF或NMP新鲜配制高浓度（0.2-0.3 M）溶液，确保偶联效率。

2. 偶联条件强化

   • 偶联剂：首选低消旋风险的组合，如DIC/Oxyma 或 HATU/HOAt/DIEA。

   • 温度与时间：室温下延长偶联时间（1-2小时），或采用微波辅助（50°C， 5-10分钟）提高效率。

   • 双偶联：对于磷酸化位点之后的氨基酸，建议进行双偶联以确保完全延伸。

3. Fmoc脱保护条件微调

   • 使用标准20%哌啶/DMF，但时间控制在2-5分钟，避免长时间碱暴露。

   • 可监测茚三酮或溴酚蓝测试，确保脱保护完全但不过度。

4. 全局脱保护的“鸡尾酒疗法”

   • 标准强化配方：TFA : H₂O : TES : DODT = 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v)

     
     

     针对苄基的强化配方（当多个苄基存在时）：TFA : H₂O : TES : m-甲酚 = 88 : 5 : 2 : 5 (v/v)

   • 切割时间：延长至3-4小时，确保苄基完全脱除。

   • 替代方案：若磷酸酪氨酸苄基难以脱除，可加入少量硫基试剂（如DODT）或使用含1%三氟甲磺酸的TFA。

5. 树脂与连接子的选择

   • 推荐使用高度溶胀的树脂（如Polyethylene glycol-based ChemMatrix®），以容纳亲水性磷酸肽链。

   • 连接子应考虑最终产物形式：若需C端酰胺，使用Rink Amide树脂；若需游离酸，使用Wang树脂。

四、 替代策略：合成后磷酸化

1. 固相磷酸化

   • 先合成含未保护Ser/Thr/Tyr的肽树脂，然后在树脂上用磷酸化试剂（如二苄基N,N-二异丙基亚磷酰胺，随后氧化）引入磷酸基团。

   • 优点：避免使用昂贵单体，可灵活选择磷酸化位点。

   • 缺点：区域选择性难以控制，反应效率可能不均一，副产物多。

2. 溶液相磷酸化

   • 将全保护或部分保护的肽段在溶液中磷酸化。

   • 挑战：需要羟基具有显著的反应性差异，且磷酸化试剂可能与肽中其他基团反应。

五、 纯化与分析的特殊考量

1. 纯化策略

   • 磷酸肽极性大，在反相HPLC上保留弱。可采用：

     • 离子对色谱：使用TFA或庚氟丁酸作为离子对试剂，增加保留。

     • 亲水相互作用色谱（HILIC）：作为反相的补充，特别适合高度磷酸化的肽段。

     • 两步纯化：先通过离子交换粗纯，再用反相精纯。

2. 表征技术

   • 质谱：

     • ESI-MS中观察[M+nH]ⁿ⁺多电荷离子。

     • 在MS/MS中，磷酸酯易发生中性丢失（-98 Da, H₃PO₄；或 -80 Da, HPO₃），这是磷酸化的特征信号。

   • ³¹P NMR：直接确认磷酸基的存在，化学位移（δ）通常在-0.5至3 ppm（磷酸单酯）。

   • 磷酸特异性染色：如聚丙烯酰胺凝胶电泳后用Pro-Q Diamond磷酸荧光染色。

3. 稳定性存储

   • 磷酸肽在溶液中易水解，建议以冻干粉形式-20°C保存。

   • 避免反复冻融，溶液现配现用。

六、 前沿进展与复杂应用

1. 多重磷酸化与动态修饰模拟

   • 合成含相邻磷酸化位点（如pSer-pSer）的肽段，研究其协同效应。

   • 开发光敏或条件敏感的保护基，实现磷酸化的时空可控“激活”，模拟动态修饰过程。

2. 磷酸化依赖性相互作用研究

   • 设计含磷酸化位点的肽段，用于筛选结合蛋白（如SH2、14-3-3结构域），或作为抑制剂阻断病理性的蛋白-蛋白相互作用。

3. 磷酸化糖肽合成

   • 同时含有磷酸化和糖基化的肽段，代表了极端的合成挑战，需要多层正交保护策略。

4. 非天然磷酸类似物

   • 合成膦酸酯（C-P键）或氟代磷酸酯（更稳定）的肽类似物，作为不可水解的激酶底物或抑制剂。

总结
磷酸化多肽合成是一场在酸碱条件钢丝上行走的精密操作。化学家必须像战略家一样，为脆弱的磷酸基团选择合适的“盔甲”（保护基），规划安全的“行军路线”（合成策略），并准备温和的“卸甲仪式”（脱保护条件）。随着新型保护基和生物正交化学的发展，这一领域正朝着合成更复杂、更接近天然动态修饰系统的方向前进，为解码磷酸化密码提供了不可替代的化学工具。

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