南京肽业YM说多肽|长肽与蛋白质全合成：超过100个残基的合成策略、折叠辅助与案例分析

南京肽业YM说多肽

长肽与蛋白质全合成

超过100个残基的合成策略、折叠辅助与案例分析

摘要

当目标分子从数十个氨基酸的多肽，跨越到超过100个残基、具有明确三级结构的蛋白质时，传统的线性固相合成策略已近极限。这要求我们采用更宏大的“分治与组装”战略，并解决最终的折叠问题。本文将深入探讨征服蛋白质全合成领域的两种核心范式——基于保护化学的片段缩合与基于正交反应的天然化学连接，并通过胰岛素、泛素等经典案例，解析如何将合成的线性链引导至具有完整生物活性的天然构象。

一、为何挑战蛋白质全合成？

尽管重组DNA技术是生产蛋白质的主流，但化学全合成具有不可替代的优势：

1. 引入非天然元件：可在任意位点精准引入D-型氨基酸、荧光探针、稳定化修饰、翻译后修饰模拟物等，这是生物学方法难以实现的。

2. 获得均一修饰产物：对于磷酸化、糖基化等异质修饰，化学合成能获得结构绝对均一的分子。

3. 基础研究工具：用于研究蛋白质折叠、功能与结构的构效关系。

二、核心策略一：片段缩合——保护基化学的终极延伸

此策略是传统多肽片段缩合（见第二十四篇）的规模化、精密化应用。

• 核心逻辑：将目标蛋白拆分成数个（通常2-4个）长度为30-60个氨基酸的片段，分别通过固相合成制备至高纯度。然后，在溶液中使用选择性活化方法，将片段按顺序连接。

• 关键挑战与解决方案：

  1. 片段溶解度：长片段在有机溶剂中溶解度极差。解决方案：采用强溶解性溶剂（如HFIP, DMSO/DMF混合液），或对片段进行可逆的骨架临时保护（如引入Lys的ε-氨基三氟乙酰基）。

  2. 连接点消旋：片段C端的氨基酸在活化时极易消旋。解决方案：

     • 优先选择甘氨酸或脯氨酸作为C端。

     • 使用低消旋风险的活化方法，如形成3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪酯或使用DPPA。

  3. 保护基正交性：需要为每个片段的N端和侧链设计复杂的正交保护层级，以便分步连接和最终全局脱保护。常组合使用Boc, Fmoc, Z, Allyl, Dde等。

• 经典案例——核糖核酸酶A的合成：布鲁斯·梅里菲尔德团队于1969年完成了124个氨基酸的RNase A全合成。他们将蛋白拆分成几个大片段，分别用Boc策略合成，最后在溶液中通过叠氮法连接。这被誉为里程碑，证明了化学方法可以合成具有酶活性的蛋白质。

三、核心策略二：天然化学连接——革命性的汇合连接

由Stephen Kent等人发展的NCL技术，彻底改变了蛋白质合成的范式。

• 核心原理：利用两个片段末端的特异性、自发的化学反应进行连接。

  1. 一个片段必须具有C端硫酯。

  2. 另一个片段必须具有N端半胱氨酸。

  3. 两者混合时，发生转硫酯化，形成中间体，随即自发发生S→N酰基迁移，形成天然酰胺键，同时在连接点留下一个半胱氨酸残基。

• 化学反应式：
  肽段A-COSR + HS-肽段B → 肽段A-CO-S-肽段B → 肽段A-CONH-肽段B

• 巨大优势：

  1. 无消旋：反应不涉及羧基的活化，彻底消除了连接点的消旋问题。

  2. 高 regioselectivity：反应只发生在C端硫酯和N端Cys之间，条件温和。

  3. 在变性条件下进行：反应可在6M盐酸胍中进行，完美解决了长肽片段溶解度差的问题。

• 拓展与应用：

  • 表达蛋白连接：一个片段通过重组表达获得（通常含C端硫酯），另一个通过化学合成（含N端Cys），将生物发酵与化学合成优势结合。

  • 非天然氨基酸引入：在化学合成的片段中任意引入修饰。

  • 多片段顺序连接：通过设计，一个片段的C端为硫酯，N端为Cys，可作为“中枢”依次连接多个片段。

四、蛋白质折叠：从线性链到功能结构

合成出正确的线性序列，只是获得了蛋白质的“一级结构”。如何使其折叠成正确的三维构象，是最后的“惊险一跃”。

• 折叠的挑战：化学合成的蛋白质处于完全变性、去折叠状态，且可能因合成中的轻微损伤或非天然末端而影响折叠。

• 辅助折叠策略：

  1. 氧化复性：对于含二硫键的蛋白质（如胰岛素、EGF），将还原态、去折叠的合成肽链置于氧化还原缓冲液中，通过空气氧化或添加氧化还原对，引导其形成正确的二硫键配对，同时完成折叠。这是最经典的方法。

  2. 分子伴侣辅助：在折叠缓冲液中加入环糊精、脯氨酸异构酶等小分子或分子伴侣蛋白，抑制聚集，促进正确折叠。

  3. 分段折叠：先让含有局部结构域的小片段折叠，再通过NCL连接，利用已形成的局部结构引导全局折叠。

  4. 从头设计序列：在序列中引入促进折叠的模体，或去除易导致聚集的疏水斑块。

五、经典全合成案例深度剖析

案例一：胰岛素（51个氨基酸）

• 意义：首个被阐明结构并化学全合成（中国，1965年）的蛋白质，具有划时代意义。

• 策略：采用片段缩合。将胰岛素拆分成A链（21aa）和B链（30aa），分别合成。然后，在严格控制的氧化条件下，使两条链通过三对二硫键正确连接并折叠。其成功证明了通过化学方法可以获得具有完整生物活性的复杂蛋白质。

案例二：泛素（76个氨基酸）

• 意义：是现代NCL技术的展示范例。

• 策略：采用天然化学连接。将泛素拆分成两个片段，例如第1-34位（含C端硫酯）和第35-76位（N端为Cys）。在变性缓冲液中混合，高效连接得到全长序列。随后在氧化条件下形成单一的二硫键，并在适当缓冲液中自发折叠成正确的三维结构，其结构经NMR验证与天然泛素完全一致。

案例三：镜像蛋白质的全合成

• 目标：合成全部由D-型氨基酸构成的蛋白质。

• 意义：对蛋白酶完全稳定，是绝佳的研究工具和潜在 therapeutics。

• 策略：必须完全依赖化学合成。采用片段缩合或NCL，使用全D-型氨基酸构件。其成功（如镜像HIV蛋白酶）强有力地证明了化学合成在创造自然界不存在的“镜像生命”分子方面的绝对能力。

六、未来与展望

蛋白质全合成的前沿正朝着更大、更复杂的方向迈进：

• 自动化合成仪：专为长肽和蛋白质片段合成设计的自动化平台正在出现。

• 更高效的连接反应：如丝氨酸/苏氨酸连接，扩展了NCL的应用范围。

• 计算机辅助折叠设计：利用AI预测折叠路径和优化序列以提高折叠产率。

结论

长肽与蛋白质的全合成，是多肽化学的“登月工程”。它将合成化学家的角色从“链的组装者”，提升为“三维功能分子的建筑师”。无论是通过保护基层层设防的经典片段缩合，还是利用生物启发的精巧NCL，其核心哲学都是化整为零、各自精制、精准对接、引导重生。掌握这些策略，并深刻理解从化学键到三维结构的折叠逻辑，意味着我们不再仅仅是自然产物的模仿者，而是拥有了从头设计和创造具有定制化功能的、全新蛋白质机器的能力。这标志着合成化学在生命科学前沿达到了一个全新的高度——不仅能够解析生命，更能以化学的语言，重新编写和创造生命的分子基础。

南京肽业YM说多肽|长肽与蛋白质全合成：超过100个残基的合成策略、折叠辅助与案例分析