南京肽业YM说多肽

偶联试剂机理全解：

从碳二亚胺到脲鎓/磷鎓盐的活化艺术与消旋控制

摘要

在多肽合成中，将氨基酸的羧基转化为一个能与氨基高效、低消旋地形成酰胺键的活性中间体，是每一轮循环成功的化学核心。这一转化由偶联试剂驱动。从经典的碳二亚胺到现代的脲鎓/磷鎓盐，偶联试剂的演进史是一部追求更高效率、更低消旋、更好兼容性的历史。本文旨在深入分子层面，系统剖析各类主流偶联试剂的活化机理、关键中间体的命运，以及它们如何影响反应速率与手性完整性，从而为不同合成场景提供理性的选择依据。

一、核心挑战与活化目标

羧基本身与胺的反应性很弱。偶联试剂的核心任务是将羧基转化为一个高亲电性的中间体（通常是活性酯或对称酸酐），使其易于受到氨基的亲核进攻。理想偶联试剂需满足：

1. 高活化效率：快速、定量地生成活性中间体。

2. 低消旋倾向：最小化α-手性中心在活化过程中的外消旋化。

3. 副反应少：避免形成导致副产物的其他活性物种。

4. 良好的溶解性与稳定性：与SPPS体系兼容。

二、碳二亚胺类试剂：经典机制与瓶颈

以DIC和EDC为代表，是历史上最早且仍在广泛使用的偶联试剂。

• 活化机理：

  1. O-酰基异脲中间体的形成：碳二亚胺的累积双键受到羧酸负离子的亲核进攻，形成关键的 O-酰基异脲。这是一个高活性的中间体，其本身即可与胺反应。

  2. 两条竞争路径：

     • 路径A（目标）：氨基直接进攻O-酰基异脲，形成肽键并释放出二烷基脲。

     • 路径B（副反应与消旋之源）：O-酰基异脲可发生分子内[1,3]-酰基迁移，重排为更稳定但无反应活性的N-酰基脲，这是死端副产物。更严重的是，O-酰基异脲在碱存在下可通过形成噁唑酮导致严重的消旋。

• 添加剂（HOBt, HOAt, Oxyma）的革命性作用：

  • 作用机理：它们不是“催化剂”，而是协同试剂。它们作为更优秀的亲核体，抢先与O-酰基异脲反应，生成活性酯（如HOBt酯、Oxyma酯）。

  • 三大优势：

    1. 抑制消旋：活性酯的生成速度远快于O-酰基异脲重排为噁唑酮，从而切断了消旋的主要路径。

    2. 提高效率：生成的活性酯比O-酰基异脲更稳定、更具反应选择性，与胺的反应更高效。

    3. 抑制N-酰基脲：消耗了O-酰基异脲，减少了死端副产物的形成。

  • 典型体系：DIC/HOBt 或 DIC/Oxyma 成为经典的“原位”活化组合。

三、脲鎓盐与磷鎓盐类试剂：预活化与高效能的代表

为解决碳二亚胺体系的某些局限（如EDC水溶性过强、难去除），并追求更高活性，发展了基于脲鎓和磷鎓盐的试剂，以HBTU, HATU, HCTU, PyBOP等为代表。

• 共同特点：它们通常以六氟磷酸盐形式存在，与羧酸和碱（如DIEA）反应，不经过O-酰基异脲中间体，直接生成活性更高的物种。

• HATU为代表的脲鎓盐机理：

  1. 去质子化与交换：羧酸在DIEA作用下生成羧酸根，进攻HATU中心碳，瞬时生成活性极高的O-酰基四甲基氟代脲中间体。

  2. 生成活性酯：该中间体极不稳定，立即被体系中游离的HOAt（来自HATU的分解或额外添加）捕获，生成HOAt活性酯和副产物四甲基脲。

  3. 优势：HOAt酯比HOBt酯反应性更高（由于其更强的吸电子效应和更优的离去基团），尤其能显著降低空间位阻氨基酸偶联时的消旋率，被誉为“金牌”偶联试剂。

• PyBOP为代表的磷鎓盐机理：

  1. 羧酸根进攻PyBOP的磷中心，生成类似的酰氧基磷鎓中间体。

  2. 该中间体同样被HOBt捕获，生成HOBt活性酯，副产物为六甲基磷酰三胺。

  3. 优势：PyBOP活化过程中不产生导致消旋的中间体，且副产物HMPA是强溶剂，有助于溶解困难序列。

• 新一代磷鎓盐：PyOxyma系列

  • 如COMU, TOTU。它们用Oxyma（氰基羟基亚氨基乙酸乙酯）替代了HOBt/HOAt作为内置的协同试剂。

  • 优势：Oxyma酯活性极高，消旋控制优异，且其副产物水溶性极好，易于从产物中洗涤去除，是解决“困难序列”和实现绿色合成的先进选择。

四、机理对比与消旋控制深度解析

消旋主要发生在活化步骤，当α-质子被夺取形成烯醇化中间体时。

• 碳二亚胺路径的风险：其O-酰基异脲中间体，尤其在碱存在下，极易环化为5(4H)-噁唑酮，该对称结构是导致严重消旋的元凶。

• 鎓盐路径的优势：它们通过快速形成活性酯绕过了O-酰基异脲和噁唑酮。活性酯的烯醇化倾向远低于O-酰基异脲和对称酸酐。

• 添加剂的关键角色：HOAt > Oxyma > HOBt 在抑制消旋方面的效能依次递减。HOAt的富电子氮原子能与活性酯的羰基形成分子内氢键，稳定其结构，并使其具有更佳的“拟四面体”过渡态几何，从而最大化地抑制消旋。

五、实战选择指南：从常规到困难序列

选择偶联试剂是一个权衡反应性、消旋控制、副产物和成本的决策。

1. 常规序列，标准操作：

   • DIC/HOBt 或 DIC/Oxyma：性价比高，效果可靠，是大多数实验室的默认选择。Oxyma比HOBt抑消旋效果略好，且产生的副产物更易去除。

2. 易消旋氨基酸（Cys, His, Fmoc-AA-OH）或高光学纯度要求：

   • HATU/DIEA 或 HCTU/DIEA：首选方案。HOAt基试剂提供顶级的消旋控制，尤其对于组氨酸等。

   • PyBOP/DIEA：也是极佳选择，特别适用于His。

3. “困难序列”（长链、易聚集）：

   • HATU/DIEA：高活性可强行驱动偶联。

   • PyBOP/DIEA：其副产物HMPA是强离液剂，有助于溶解聚集的肽链。

   • DIC/Oxyma 结合加热：经济且有效的组合，Oxyma的抑消旋和促溶效果与加热协同。

4. 大规模生产与成本控制：

   • DIC/Oxyma：在保证良好效果的同时，成本显著低于HATU等鎓盐试剂。

5. 特殊注意事项：

   • 预活化 vs. 原位活化：对于易消旋氨基酸，推荐预活化（将氨基酸与偶联试剂、添加剂在加入树脂前混合反应30秒-1分钟），以确保活性酯完全形成，减少在树脂上的消旋时间。

   • 碱的选择与浓度：DIEA是最常用碱，但其过量可能促进消旋。对于敏感氨基酸，可考虑使用更弱的碱（如N-甲基吗啉）或精确控制DIEA当量。

六、未来展望：更绿色、更智能的偶联化学

当前趋势是开发副产物无毒、水溶性好、原子经济性更高的试剂（如基于Oxyma的新一代试剂），以及探索无外加碱的偶联体系。同时，对反应机理的深入理解正推动着针对特定难题（如脯氨酸偶联、N-甲基氨基酸偶联）的专用试剂设计。

结论

偶联试剂是将保护氨基酸的化学势能转化为肽键形成动力的核心引擎。从碳二亚胺依赖添加剂“救赎”的经典力学，到脲鎓/磷鎓盐“精密设计”的高效能动力学，其演进揭示了多肽合成化学向着更高选择性、更低副反应不懈追求的本质。掌握这些试剂的机理，意味着您不再仅是配方使用者，而是能够根据序列的“基因”（氨基酸组成、长度、修饰），为其匹配最合适的“动力系统”，从而在分子装配的竞赛中，同时赢得速度与精度。

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