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探索肽类泛素化的新策略:N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸的合成与应用

N-tert-Butoxycarbonyl-N-(2-(tritylthio)ethoxy)glycine as a Building Block for Peptide Ubiquitination

Lingling Peng, Elizabeth Helgason, Rafael Miranda, Jeffrey Tom, Jennifer Zhang, Erin C. Dueber, and Aimin Song

Bioconjugate Chemistry 2024 35 (2), 245-253

DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.3c00541




泛素化是真核生物蛋白质的一种关键的翻译后修饰方式,对于多种生物学过程具有重要作用。本文介绍了一种新型的肽类泛素化构建模块——N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸,并展示了其在合成具有多种修饰的泛素化肽段中的应用。

理论背景

泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白,通过其C末端与靶蛋白的赖氨酸侧链形成共价键连接,从而实现泛素化。泛素化和去泛素化过程的复杂性体现在人类基因组编码的2个E1酶、约40个E2酶、超过600个E3酶和近100个DUBs。泛素化肽段的高纯度和足够数量的制备对于研究泛素化至关重要。

研究缺口

尽管已有多种泛素化肽段的合成方法,但在合成过程中仍存在一些挑战。例如,辅助基团的安装效率受到肽段序列的影响,长肽段的合成效率较低;磷酸化肽段在辅助基团安装过程中可能会部分失去磷酸基团;辅助基团安装必须作为肽段合成的最后一步,因为生成的N-(2-三苯甲基硫乙氧)甘氨酸基团对酰化反应仍然敏感,这会干扰进一步的修饰,如荧光标记。

研究目的与贡献

本研究旨在通过预合成具有适当保护基团的甘氨酸辅助基团,克服上述挑战。研究开发了N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸作为肽类泛素化的构建模块,该模块与固相Fmoc化学合成和常见的肽段修饰(包括磷酸化、甲基化、乙酰化、生物素化和荧光标记)完全兼容。

研究方法概述

研究团队首先合成了N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸,并通过固相合成方法将其引入到肽段中。通过优化肽段的解离和辅助基团的去除条件,成功合成了七种带有不同修饰的泛素化组蛋白和Tau肽段。此外,研究还证实了合成的泛素化肽段的结构完整性和折叠情况。

论文组织结构

论文首先介绍了泛素化的背景和重要性,然后详细描述了N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸的合成过程和在肽类泛素化中的应用。最后,论文展示了合成的泛素化肽段在酶促去泛素化实验中的应用,并讨论了研究的意义和结论。

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图表1:使用N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸合成的泛素化肽段设计与合成(方案3)


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图表2:使用文献方法和N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸合成的H2A(113−129)-Aux的LC−MS分析结果(紫外检测在220 nm)

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图表3:FAM-H2B(117−127)-K120Ub的酶促去泛素化反应。A) UCH-L3处理前后的FAM-H2B(117−127)-K120Ub的总离子流图谱。B) SDS-PAGE分析结果,左侧为荧光扫描,右侧为考马斯亮蓝染色。C) UCH-L3催化的FAM-H2B(117−127)-K120Ub去泛素化反应的荧光偏振分析结果。

通过这项研究,作者们为泛素化肽段的合成提供了一种新的策略,为未来的泛素化研究和药物开发提供了有力的工具。


概述

N-Boc-N-(2-(tritylthio)ethoxy)glycine被开发为一个用于肽泛素化的构建块,全面兼容固相Fmoc化学和常见的肽修饰,包括磷酸化、甲基化、乙酰化、生物素化和荧光标记。通过这个构建块的应用,成功合成了七种带有多样化修饰的泛素化组蛋白和Tau肽。Cys残基被良好容忍,不需要正交防护。通过对荧光标记的泛素结合体的酶促去泛素化确认了合成的泛素化肽的结构完整性和折叠。这种合成策略提供了一种实用的方法,用于制备带有多样化修饰的泛素化肽。

背景

本论文的背景是围绕泛素化(Ubiquitination)的化学合成领域,特别是非酶方法制备泛素化肽段的研究。泛素(Ub)是一种consist75个氨基酸的小蛋白,在真核生物中高度保守。它通过后翻译修饰作用与靶蛋白的赖氨酸侧链结合,这一过程由一系列酶催化,并且具有一系列的生物学重要性,如调节蛋白质稳定性、调控信号传递等。人类基因组编码了大量的与Ub相关的酶,如E1激活酶、E2结合酶、E3泛素连接酶,以及接近100种去泛素化酶(DUBs)。因此,能高度纯度与充足量地制备Ub结合物,对于研究泛素化机理至关重要。

化学合成方法提供了精确控制Ub结合物组成的手段,允许在不同位点特异性地引入非天然的氨基酸、探针基团、功能基团以及非肽化学键等,目前已有多种基于此目的的化学合成泛素化肽段的策略被提出。这些策略包括使用各式各样的辅助团和标记分子来促进或简化Ub与靶肽的化学连接。然而,这些传统方法在操作上存在诸多挑战,例如低效率、序列依赖性差、修饰敏感性等,限制了泛素化化合物的合成和应用。

因此,文章中提出了开发一种新型合成单元N-Boc-N-(2-(tritylthio)ethoxy)glycine,用于通过固相法合成泛素化肽段。该合成单元与固相合成中常见的修饰技术(如磷酸化、甲基化、乙酰化、生物素化和荧光标记)兼容,为制备具有多样化修饰的泛素化肽段提供了一条实用的途径。利用该建筑块,作者成功合成了多种带有不同修饰的泛素化组蛋白和Tau肽,证明了这一策略在制备具有多样化修饰的泛素化肽段方面的可行性和实用性。

方法

从所提供的论文中,我们确定该研究采用了“实验研究”方法。以下是对其研究方法的全面描述。

该研究的目标是开发N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸作为一种肽类泛素化的构建块,扩展了2-(氨基氧基)乙烷硫醇辅助策略的应用范围。论文详细报道了通过固相合成方法制备了一系列经泛素化的肽段。为验证所开发的构建块的有效性和通用性,研究人员选择了多种修饰的肽段进行合成,包括磷酸化、甲基化、乙酰化、生物素化和荧光标记。

在研究过程中,首先采用文献中的方法合成了O-(2-(三苯基硫)乙基)羟胺。接着,通过Boc保护氨基氧基,随后与甲基溴乙酸酯在钠氢化物存在下进行烷基化,最后通过三甲基锡氢化物对甲基酯进行皂化,制得N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸。通过三步反应,总产率为19%。研究中使用了阿司匹林H2A(113−129)作为模型肽段,来研究N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸在肽类泛素化中的应用。

研究中不仅展示了所开发构建块在固相肽合成中的兼容性,还证明了它与常见的肽修饰策略兼容。例如,在合成荧光标记的K119 Ub结合肽H2A(113−129)时,研究人员在肽链组装完成后保留了N-末端Fmoc,Mtt保护组在K119的ε-氨基上被移除,然后将构建块4与K119的侧链偶联,接着去除N-末端Fmoc,并通过TFA切除和RP-HPLC纯化得到了附助体载有的N-(5-FAM)-H2A(113−129)。此外,还通过运用该构建块成功合成了含有不同修饰的七个泛素化的组蛋白和Tau肽段。

总结来说,该研究成功开发了N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸作为泛素化肽类的构建块,并通过实验研究方法验证了其在肽类泛素化中的应用,证明了其与固相Fmoc化学和多种肽修饰(磷酸化、甲基化、乙酰化、生物素化和荧光标记)的兼容性。这项工作为进一步探索和理解肽类泛素化过程提供了有价值的工具和策略。

结论
  • 摘要:开发了一种用于肽类泛素化的构建块N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸,完全兼容固相Fmoc化学和常见的肽类修饰。
  • 结果与讨论:
    • LC-MS分析显示,使用文献方法合成的H2A(113−129)-Aux与使用N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸建筑块的比较结果,后者提高了粗纯度至51%。
    • 经过优化反应条件后,通过使用0.1 M氯化锌显著提高了辅助基团移除的效率(约74%),最终纯化得到的H2A(113−129)-K119Ub总收率为20%。
    • 成功合成了包含不同修饰(如磷酸化、甲基化、乙酰化、生物素标记和荧光标记)的七种泛素化组蛋白和Tau肽。
  • 结论:N-Boc-N-(2-(三苯基硫)乙氧基)甘氨酸作为肽类泛素化的构建块,兼容Fmoc SPPS和多种肽类修饰,能够承受Cys残基而无需正交保护,对于准备具有多样化修饰的泛素化肽类非常理想。

探索肽类泛素化的新策略:N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫)乙氧)甘氨酸的合成与应用

N-tert-Butoxycarbonyl-N-(2-(tritylthio)ethoxy)glycine as a Building Block for Peptide Ubiquitination

Lingling Peng, Elizabeth Helgason, Rafael Miranda, Jeffrey Tom, Jennifer Zhang, Erin C. Dueber, and Aimin Song

Bioconjugate Chemistry 2024 35 (2), 245-253

DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.3c00541



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