固相法合成丙型肝炎疫苗多肽工艺研究

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固相法合成丙型肝炎疫苗多肽工艺研究

孙立枢

西北大学

摘要：本文以工业化生产为目的，研究了用Fmoc固相法人工合成丙型肝炎疫苗多肽(以下简称疫苗多肽)的生产工艺，比较了Wang树脂和二氯三苯甲基树脂(以下简称二氯树脂)在固相合成中的的优势和劣势，以及粗产物肽和目标肽的产率和纯度；创造性的引入Nα-Dmb基团，提高了困难氨基酸Val的连接率；优化了脱保护的策略以及切割试剂的选择；通过质谱鉴定分析所得目标多肽的分子量，用RP-HPLC进行粗肽的分析和纯化，系统完整的建立了整套合成纯化工艺路线及相关的工艺参数，为后续的工业化生产奠定了坚实的基础。采用该合成纯化工艺路线，以二氯树脂为载体，合成的粗肽产率达到了90.76％，纯化后的目标肽产率为63.02％纯度达到了98.5％，并实现了18克每批的合成量。二氯树脂以其高效率、低成本、产品的高纯度完全符合工业化生产疫苗多肽的各项经济技术指标。论文包括以下四个部分： 1文献综述部分，简述了丙型肝炎疫苗的研究现状，详细介绍了多肽固相合成技术中的合成方法、分离纯化与鉴定技术，最后概述了多肽类药物的应用情况与研究展望。 2采用Fmoc固相法人工合成了疫苗多肽，比较了两种树脂在合成过程中的异同点，对合成过程中的几个重要步骤和难点进行了优化和改进，如针对困难氨基酸Val的连接，设计了引入Nα-Dmb基团的独特合成策略，提高了连接率及切割效率，确定了合成工艺中相关的各项工艺技术参数。最后用二氯树脂做为载体进行了18克每批的疫苗多肽合成。 3用RP-HPLC进行粗肽的分析和纯化，根据疫苗多肽的理化性质采用乙腈—水的流动相体系，并确定了RP-HPLC分析和纯化的条件。 4总结了实验结果，确定了疫苗多肽合成、纯化工艺路线及相关的工艺技术参数。
关键词： 固相法;丙型肝炎疫苗多肽;多肽纯化;
专辑： 医药卫生科技
专题： 基础医学
分类号： R392
导师： 陈五岭;
学科专业： 微生物学
硕士电子期刊出版信息： 年期：2007年第04期网络出版时间：2007-03-16——2007-04-15

固相法合成丙型肝炎疫苗多肽工艺研究|孙立枢|西北大学
固相法|丙型肝炎疫苗多肽|多肽纯化

文章目录
摘要
Abstract
第一章文献综述
1.1 丙型肝炎简介
1.1.1 丙型肝炎病毒基因的多样性
1.1.2 治疗方法
1.1.3 HCV疫苗
1.1.4 DNA疫苗
1.1.5 HCV疫苗研究的挑战
1.2 多肽合成技术
1.2.1 固相法多肽合成
1.2.2 固相法中的接肽反应方法
1.2.3 氨基酸保护基
1.2.4 载体树脂
1.2.5 脱去保护基和树脂
1.2.6 固相多肽合成中连接效率的检测方法
1.2.7 多肽固相合成法中存在的问题及解决策略
1.2.8 固相多肽合成中新技术的应用
1.3 合成多肽的分离与分析
1.3.2 分析方法
1.4 多肽药物
1.4.1 多肽药物的药代动力学与其检测方法
1.4.2 多肽药物的研究开发
第二章疫苗多肽的固相合成
2.1 仪器和设备
2.1.1 试剂
2.1.2 多肽合成实验装置图
2.2 使用载体Wang树脂合成疫苗多肽
2.2.1 Wang树脂简介
2.2.2 树脂的活化
2.2.3 第一个氨基酸残基的连接
2.2.4 树脂上残余反应基团的封闭
2.2.5 剩余氨基酸残基的连接
2.2.6 脱保护方法
2.2.7 检测方法
2.2.8 树脂的切割
2.2.9 合成粗肽的MALDI-TOF MS鉴定
2.3 使用载体二氯树脂合成疫苗多肽
2.3.1 二氯树脂简介
2.3.2 其他合成环节
2.4 结果与讨论
2.4.1 保护基的选择
2.4.2 载体树脂的选择
2.4.3 第一步的连接效率
2.4.4 第一步连接过程的不同
2.4.5 困难氨基酸Val的连接
2.4.6 未反应氨基酸的封闭
2.4.7 脱保护策略
2.4.8 切割试剂的选择
2.4.9 粗肽的质谱鉴定
2.4.10 合成结果
2.4.11 扩大规模的疫苗多肽合成
2.5 小节
第三章疫苗多肽的分析与纯化制备
3.1 前言
3.2 实验部分
3.2.1 仪器设备
3.2.2 试剂及药品
3.2.3 粗肽的分析
3.2.4 粗肽的纯化
3.3 结果与讨论
3.3.1 粗肽分析图
3.3.2 杂质的产生
3.3.3 粗肽纯化图
3.3.4 目标肽的纯度与产率
3.4 小节
第四章结论与展望
4.1 结论
4.2 展望
参考文献
中英文词汇对照表
致谢

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