无菌药品生产企业过程污染微生物菌株库的建立及数据分析

       药物分析杂志 2019, Vol. 39  Issue (11): 1954-1960.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.11.05

宋明辉 , 李琼琼 , 秦峰 , 刘浩 , 杨美成     

SONG Ming-hui, LI Qiong-qiong, QIN Feng, LIU Hao, YANG Mei-cheng    

药品，尤其是注射液、注射用无菌粉末、眼用制剂等高风险无菌产品，如在生产、贮存过程中被微生物污染，会造成临床患者感染甚至死亡等严重不良后果^[1-3]。2015-2017年，美国FDA公布的药品召回事件中，由微生物污染风险引起的召回事件占到了50%^[4]，因此药品（尤其是无菌药品）生产企业能否实现产品中微生物污染的有效控制，已成为企业的生命线。药品污染的微生物可能来源于药品生产、运输、使用等多个环节，且药品微生物污染具有不均匀性，仅依靠对终产品抽样进行无菌检查无法确保发现问题。加强药品生产过程的微生物控制是防止问题药品流入市场和保障人民用药安全的关键^[5]。《中华人民共和国药典》2020年版编制纲要突出强调了药品质量全过程控制的重要性，由药品终端控制向生产过程控制延伸，指出了我国药品提高质量和医药产业升级的努力方向。

实现药品生产过程微生物的有效控制，需要企业建立完善的污染微生物监控方案、微生物鉴定方法及微生物数据库^[6]。目前，多数药品生产企业往往仅实现了主要核心生产区域的微生物监控和污染微生物数量的统计，并未对污染微生物进行种属鉴定分析，更未建立覆盖生产全过程、全环节的污染微生物数据库。对药品生产过程污染微生物的有效收集、精准鉴定、聚类分析，不仅能够快速追溯产品污染微生物来源，还能够帮助企业根据监控污染微生物种类制定更有效的清洁消毒措施，有效降低微生物负载，并阻断污染途径。因此，本研究结合我国药品监管和企业生产过程微生物控制需求，通过无菌药品生产企业的案例示范，建立了覆盖药品生产全过程的污染微生物数据库，能够为真正实现药品质量过程控制和保障药品安全提供有力支撑。

AB 9700型PCR扩增仪（Thermo Fisher公司）；琼脂糖凝胶电泳仪及成像系统（Bio-Rad公司）；MIR-254型培养箱（SANYO公司）；LABGARD型生物安全柜（Nuaire公司）；AB3500基因分析仪（Thermo Fisher公司）；胰酪胨大豆琼脂平板（TSA，广东环凯公司）；细菌基因组提取试剂盒及Premix Taq^TM DNA聚合酶试剂盒（TAKARA，大连宝生物工程有限公司）。

选取某无菌药品生产企业，参照《药品生产质量管理规范》（2010年版）、《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）（2015年版）、ISO和PDA等相关标准和规范，制定覆盖药品生产过程的微生物监控、检测与鉴定方案。分别对原辅料、包装材料、生产人员、生产环境、制药用水和药品微生物检测实验室等多个环节，进行微生物监控和检测，监控周期为3个月。

药品生产过程污染微生物的检测与分离，参照《中国药典》2015年版< 1101无菌检查法 > < 1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 > < 9202非无菌产品微生物限度检查指导原则 > < 9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 > 等方法进行微生物检测。微生物阳性样本划线接种到TSA平板或血平板，放置在适宜条件下（需氧或厌氧条件）培养。菌落形态观察后，依据平板上菌落形态特征，分别挑取不同特征菌落划线接种到TSA平板，用于菌种鉴定。

将分离纯化菌株接种到TSB液体培养基，过夜培养。采用细菌基因组提取试剂盒，进行基因组DNA的提取，使用16S rRNA基因通用引物27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTC AG-3’）和1492R（5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’）进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳后，将PCR阳性扩增产物进行双向测序。利用软件Lasergene 7.0校正和拼接核酸序列^[7]，然后进行16S rRNA序列的Blast比对分析，依据比对结果进行菌种判定（同源性 > 98.65%判定为同一菌种^[8]）。同时采用VITEK生化鉴定系统及MALDITOF MS质谱方法，对部分结果可疑的菌种进一步鉴定，基于微生物多相分类鉴定信息，判定微生物种属信息。

从无菌药品生产过程分离纯化292株微生物，污染微生物在不同监控项目中的分布如表 1所示。除包装材料和微生物检验实验室没有监测到微生物外，其余监控项目均有微生物污染。其中生产环境分离微生物最多，达到212株，占全部污染微生物的72.6%；其次是生产用水（13.4%）、原辅料（10.3%）、生产人员（3.77%）。不同洁净级别生产环境中，C级洁净区微生物分离率最高（38%），值得关注的是A级洁净区域也分离出30株微生物。

表 1 不同监控项目微生物污染情况Tab.1 Microbial contamination analysis of different monitoring items

基于多相鉴定分析，对药品生产过程分离的292株微生物进行鉴定。鉴定后结合菌株分离背景，剔除可能重复分离株，最后共获得241株微生物。菌株鉴定结果表明，241株微生物分布于44个属，95个种（表 2、3），药品生产过程污染的微生物种类非常丰富。其中，葡萄球菌污染率最高，占全部污染微生物的40.25%；其次是微球菌（11.20%）、芽孢杆菌（8.30%）和不动杆菌（5.81%）。微生物种水平鉴定结果分析表明，科氏葡萄球菌是药品生产过程污染率最高的菌种，占全部污染微生物的13.69%，其次是表皮葡萄球菌（11.20%）、灿烂类芽孢杆菌（4.15%）和人葡萄球菌（4.15%）。

表 2 药品生产过程污染微生物属水平鉴定结果Tab.2 Genus level identification results of microorganism strains isolated from drug manufacturing process

表 3 药品生产过程主要污染微生物种水平鉴定结果Tab.3 Species level identification results of microorganism strains isolated from drug manufacturing process

241株污染微生物中来自无菌原料生产区129株，无菌制剂生产区112株。2个生产区域污染微生物的种群多样性分析结果如图 1所示，表明10个属的微生物占到了原料生产区和制剂生产区污染微生物的80%。2个生产区域中葡萄球菌都是污染最严重的微生物，其次是微球菌。在不同生产区域都存在特定的污染微生物种类，如芽孢杆菌、不动杆菌和鞘氨醇单胞菌仅在无菌原料生产区域检测到，而类芽孢杆菌、戈登氏菌和斯科曼氏球菌则主要存在于无菌制剂生产区。无菌原料生产区和无菌制剂生产区不同监控项目中污染微生物的种群结构显示，葡萄球菌和微球菌广泛存在于多个监控项目中。在无菌原料生产区的B级洁净区域分离到63株微生物，而无菌制剂生产区的B级洁净区域仅分离出8株微生物。芽孢杆菌主要存在于无菌原料生产区的活性炭材料中，而不动杆菌则主要存在于注射用水中。A级洁净区域污染的微生物主要包括葡萄球菌、微球菌和类芽孢杆菌等。

A.无菌原料生产区（raw material production area）B.无菌制剂生产区（sterile preparation production area）图 1 药品生产过程中不同监控项目污染微生物种群多样性分析（横坐标指每个监控项目中不同属细菌数量占这个监控项目总细菌数量的百分比）Fig.1 Bacterial population diversity analysis of different monitoring area in drug manufacturing process (The abscissa refers to the percentage of each genus strain number in the total number of this monitoring project)

葡萄球菌是药品生产过程的主要污染微生物，本研究共分离到97株葡萄球菌，占到全部污染微生物的40.3%，分布于10个不同的葡萄球菌种，如表 4所示。其中，科氏葡萄球菌污染最严重，检测分离到33株，其次是表皮葡萄球菌（27.8%）、人葡萄球菌（10.3%）、溶血葡萄球菌（6.19%）。

表 4 药品生产过程污染葡萄球菌的种群多样性分析Tab.4 Diversity analysis Staphylococcus strains isolated from drug manufacturing process

本研究对示范企业无菌药品生产工艺和厂区布局调研后，建立了包含原辅料、包装材料、生产人员、生产环境、制药用水和药品微生物检测实验室等项目的监控程序。监控结果显示，生产环境中污染微生物的分离率最高，占全部污染微生物的72.6%。值得关注的是，A级洁净区分离到30株微生物，表明无菌药品终产品具有很高的微生物污染风险，提示企业需启动微生物数据偏差（MDD）调查。目前多数药品生产企业往往只针对核心生产区域A/B级进行微生物监控，而忽略了其他区域和环节微生物污染的风险。前期研究表明，药品终产品中污染微生物可来自于原辅料^[9-10]、配料间和洗瓶^[11]、生产人员^[12]等。本研究结果显示，原辅料、生产人员、制药用水中也都监测到微生物污染，存在污染药品终产品的风险，企业应加强相关项目的微生物监控和风险评估。

基因型鉴定方法如16S rRNA序列比对方法、细菌DNA特征序列鉴定法等，比生化表型鉴定方法更加稳定可靠，已逐渐成为细菌鉴定的主要技术手段^[13-14]。本研究采用基于16S rRNA序列比对等方法对药品生产过程监控微生物进行了鉴定，共发现44个属，95个种，表明药品生产过程污染微生物种类繁杂，对微生物鉴定技术提出了更高要求。与前期研究^[15]一致，本研究基于16S rRNA序列比对方法能够实现大多数细菌的准确鉴定。但任何单一的微生物鉴定方法都不能实现所有微生物菌株的准确鉴定，16S rRNA序列比对方法能够给出准确的属水平鉴定结果，但部分菌种如头状葡萄球菌和山羊葡萄球菌不能准确鉴定到种^[16]。因此，本研究结合VITEK生化鉴定系统及MALDITOF MS质谱方法，能够实现全部污染微生物的种水平准确鉴定。此外，基于16S rRNA序列便于建立标准化的核酸信息数据库，能够基于16S rRNA序列的亲缘聚类分析有效监控生产过程污染微生物的遗传进化，为药品生产过程污染微生物的风险评估提供依据。

研究表明，制药企业生产环境中污染微生物大部分都是由人员带入^[17-18]。本研究与前期研究结果一致，药品生产环境中污染的微生物，以人源携带微生物为主，如葡萄球菌、微球菌等，表明生产人员是环境微生物负载的主要来源。因此，企业应加强生产人员的卫生培训和无菌操作意识，生产人员的规范操作是企业实现药品生产过程污染微生物有效控制的关键。A级洁净区污染的微生物主要包括葡萄球菌、微球菌、类芽孢杆菌等，也都属于人源携带微生物。A级洁净区污染微生物具有极大污染药品终产品的风险，因此，严格控制生产人员的带菌、控制人员流动是保障A级洁净区域微生物控制的关键。

药品企业厂区微生物分布地图是指通过对药品生产过程监控收集的污染微生物进行鉴定，基于微生物监控的历史数据，从污染微生物种属信息和引入来源等方面进行分析，获取药品生产过程特定区域污染微生物的分布规律。建立药品企业厂区污染微生物分布地图是追溯产品污染微生物来源的有效方法，也是药品生产过程消毒剂选择的重要依据。同时能够指导生产车间制定有效的微生物控制措施，降低微生物负荷，提高无菌保障水平，使企业的质量管理和无菌保障更加完善。本研究发现，一些微生物种群的分布具有明显的特异性，如芽孢杆菌主要存在于活性炭材料中，而不动杆菌则主要存在于注射用水中。因此，药品企业非常有必要建立全面的厂区微生物分布地图，根据污染微生物的种群分布的特异性，更好指导药品生产过程污染微生物的溯源分析调查。

无菌药品生产企业过程污染微生物菌株库的建立及数据分析

药物分析杂志 2019, Vol. 39  Issue (11): 1954-1960.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.11.05

参考文献

无菌药品生产企业过程污染微生物菌株库的建立及数据分析

 药物分析杂志 2019, Vol. 39  Issue (11): 1954-1960.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.11.05